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生物菌種凍干保存步驟

發布時間:2022-05-13瀏覽次數:57返回列表

凍干機適用于大多數細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏,但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。生物菌種凍干保存步驟,其操作流程如下:

1、安瓿管準備

安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時,先用2%鹽酸浸泡過夜,自來水沖洗干凈后,用蒸餾水浸泡至pH中性,干燥后、貼上標簽,標上菌號及時間,加入脫脂棉塞后,121℃下高壓滅菌15-20分鐘,備用。

2、保護劑的選擇和準備

保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時,應注意其濃度及pH值,以及滅菌方法。如血清,可用過濾滅菌;牛奶要先脫脂,用離心方法去除上層油脂,一般在100℃間歇煮沸2-3次,每次10-30分鐘,備用。

3、凍干樣品的準備

在適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期,進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》(試行)),與保護劑混合均勻,分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例,為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要濺污上部管壁,每管分裝量約0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,裝量為半個球部。若是液體培養的微生物,應離心去除培養基,然后將培養物與保護劑混勻,再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短,在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。

4、預凍

一般預凍2小時以上,溫度達到-20℃到-35℃左右。

5、冷凍干燥

采用凍干機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內,開始冷凍干燥,時間一般為8-20小時。

終止干燥時間應根據下列情況判斷:

安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀;

真空度接近空載時的-高值;

樣品溫度與管外溫度接近;

選用1-2支對照管,其水份與菌懸液同量,視為干燥完結;

選用一個安瓿管,裝1-2%氯-化鈷,如變深蘭色,可視為干燥完結;

冷凍干燥完畢后,取出樣品安瓿管置于干燥器內,備用。

6、真空封口及真空檢驗

將安瓿管頸部用強火焰拉細,然后采用真空泵抽真空,在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

7、保藏

安瓿管應低溫避光保藏。

8、質量檢查

冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查,如存活率、生產能力、形態變異、雜菌污染等。

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